Qubit vs NanoDrop, RIN y DV200: ¿pasará tu ADN o ARN el control de calidad?

Un proyecto de NGS puede retrasarse antes de llegar al secuenciador: muestras con menos material del declarado, ARN degradado durante el transporte o restos del kit de extracción que inhiben la preparación de la librería. Al llegar al laboratorio, cada muestra pasa un control de calidad (QC) que comprueba tres cosas: cantidad, pureza e integridad.

Si sabes qué mide el laboratorio y contra qué criterios, puedes anticipar el resultado. Las cifras de Macrogen que citamos proceden de nuestros criterios de QC para lecturas cortas (PDF; incluye también filas de PacBio y Nanopore) y lecturas largas (PDF); cuando damos un valor general, lo indicamos.

1. Cantidad: por qué el NanoDrop y el Qubit no coinciden

Es la duda más frecuente antes de un envío: el espectrofotómetro da una cifra y el fluorómetro, otra bastante menor. Ninguno está estropeado; miden cosas distintas.

El NanoDrop (espectrofotometría UV) convierte la absorbancia a 260 nm en concentración: una unidad de absorbancia equivale a unos 50 ng/µL de ADN bicatenario o a unos 40 ng/µL de ARN. Pero a 260 nm absorbe cualquier ácido nucleico (ADN bicatenario o monocatenario, ARN, oligos, nucleótidos libres) y también algunos contaminantes, como el fenol.

El Qubit (fluorometría) usa un colorante que solo emite fluorescencia unido a su diana: en el ensayo dsDNA, el ADN bicatenario. PicoGreen aplica el mismo principio en placa, y para ARN hay ensayos equivalentes, como RiboGreen o los kits de ARN de Qubit.

Por eso el NanoDrop suele dar una cifra igual o mayor que el Qubit. Si marca el doble o más (una referencia general, no un criterio formal), sospecha de ARN sin eliminar, de ADN degradado o de restos del kit de extracción.

Para NGS vale la fluorometría, porque las librerías se calculan sobre la masa de ADN bicatenario o de ARN. En Macrogen, el ADN se cuantifica por fluorescencia (Qubit) y su pureza se mide por absorbancia (NanoDrop); para Nanopore, la hoja de lecturas largas de los criterios de QC de Macrogen indica PicoGreen para la cantidad y Femto Pulse para el tamaño. Si declaras una cifra medida solo con NanoDrop, la muestra puede quedarse corta en recepción.

2. Pureza: 260/280 y 260/230 en pocas líneas

Los ratios de absorbancia no dicen cuánto ácido nucleico hay, sino qué más hay en el tubo. Los explicamos en detalle en la guía de preparación de muestras para Sanger; este es el resumen para NGS:

• 260/280: como referencia general, en torno a 1,8 en ADN y a 2,0 en ARN. Los valores bajos apuntan a proteínas o fenol; en ADN, un valor claramente alto puede indicar ARN contaminante.
• 260/230: como referencia general, entre 2,0 y 2,2. Los valores bajos delatan sales de guanidina, fenol, hidratos de carbono o EDTA, todos capaces de inhibir las enzimas de la preparación de librerías.
• El espectro completo dice más que los números: un máximo desplazado hacia 270 nm sugiere fenol, y una absorbancia alta en torno a 230 nm, sales. Con concentraciones muy bajas, los ratios dejan de ser fiables.

En los criterios de QC de Macrogen, la pureza aparece como requisito numérico en la librería PacBio HiFi: 260/280 entre 1,8 y 2,0 y 260/230 de al menos 2,0. En lecturas largas, la limpieza del ADN pesa tanto como su tamaño (sección 4).

3. Integridad del ARN: RIN, RQN y DV200

El ARN se degrada con facilidad: basta una RNasa o una descongelación durante el transporte. Su integridad se mide por electroforesis automatizada (Bioanalyzer, TapeStation o Fragment Analyzer); en Macrogen, el RIN se mide con Agilent Bioanalyzer.

RIN y RQN resumen el perfil en una escala de 1 (muy degradado) a 10 (íntegro). El RIN es el índice del Bioanalyzer (RIN^e en TapeStation) y el RQN, el del Fragment Analyzer. Ambos analizan todo el electroferograma, no solo el cociente entre los rRNA 28S y 18S (el «ratio rRNA»). Tienen límites: en insectos (cuyo 28S se parte al desnaturalizarse y migra con el 18S) o en hojas (por el ARN de cloroplasto), el RIN puede salir bajo con un ARN en buen estado.

El DV200 es el porcentaje de fragmentos de ARN de más de 200 nucleótidos. Se pensó para ARN fragmentado, como el de tejido fijado en formol e incluido en parafina (FFPE), donde el RIN casi siempre es bajo y apenas discrimina entre muestras.

¿Qué librería tolera un ARN degradado?

• Selección poli-A (mRNA-Seq). Captura el ARN mensajero (mRNA) por su cola poli-A del extremo 3′. Con ARN fragmentado, solo recupera los trozos cercanos a ese extremo y la cobertura se sesga hacia 3′. Necesita ARN íntegro.
• Depleción de rRNA (Total RNA-Seq, Ribo-Zero). Elimina el rRNA con sondas y conserva el resto, por lo que en general tolera mejor un ARN parcialmente degradado.
• Captura con sondas (tipo exoma de ARN). Enriquece las regiones codificantes por hibridación; es la opción habitual para ARN FFPE muy fragmentado.

Los criterios de QC de Macrogen separan dos grupos. Las librerías poli-A (TruSeq Stranded mRNA) y Ribo-Zero estándar se evalúan por RIN (7,0) y ratio rRNA (1,0), aunque la depleción de rRNA tolere mejor la degradación en general. Las pensadas para ARN FFPE (TruSeq RNA Access, SureSelect RNA Direct y SureSelect HS2 RNA) se evalúan por DV200 (50 %), con la anotación «Hold» (en espera) junto a ese umbral. Si tu ARN viene de FFPE, dilo al cotizar. Como referencia general, por debajo de un DV200 del 30 % muchos protocolos lo consideran demasiado degradado incluso para una librería de captura.

4. Integridad del ADN: lecturas cortas frente a lecturas largas

Para el ADN, las métricas equivalentes son el DIN (TapeStation, de 1 a 10) y el GQN (Fragment Analyzer, que expresa qué fracción del ADN supera un tamaño umbral). Qué es «suficientemente íntegro» depende de la tecnología.

Lecturas cortas (Illumina)

La librería fragmenta el ADN a unos cientos de pares de bases (el 350 o el 550 de TruSeq DNA PCR-Free es el tamaño de inserto), así que basta con que no esté muy degradado. En los criterios de QC de Macrogen, la mayoría de las librerías de genoma completo y exoma piden un DIN de 7,0; las variantes para metagenoma bajan a 3,0 y las de FFPE no fijan DIN. La cantidad depende del kit: sin PCR hace falta más material (1,0 µg para TruSeq DNA PCR-Free 350) que con PCR (0,1 µg para TruSeq Nano DNA 350). Si tienes poco ADN, coméntalo antes de enviar.

Lecturas largas (PacBio y Nanopore)

Aquí manda el tamaño, porque la longitud de las lecturas depende de la del ADN de partida. Hace falta ADN de alto peso molecular (HMW), y su tamaño se mide con electroforesis capilar de campo pulsado, como Femto Pulse, porque la convencional no separa bien fragmentos de decenas de kilobases. Según los criterios de QC de Macrogen, PacBio Microbial pide 3,1 µg con un tamaño medio de 15.000 pb; PacBio HiFi, un tamaño medio de 30.000 pb y la pureza ya citada, y Nanopore ONT-LSK-114, 6,0 µg con un tamaño medio de 30.000 pb.

Esos criterios añaden que el rendimiento de Nanopore varía entre muestras y flow cells según el tamaño del ADN y sus propiedades químicas: un ADN largo con restos de la extracción puede rendir poco. También piden indicar en el pedido el tamaño del genoma y la profundidad necesaria.

Para conservar el ADN largo, evita el vórtex y las congelaciones repetidas, pipetea con puntas de boca ancha y usa métodos de extracción para HMW. Al cuantificarlo, mézclalo con suavidad y mide en varios puntos del tubo, porque se reparte de forma poco homogénea. Si no puedes extraer ADN de alto peso molecular en tu laboratorio, consúltanos antes de enviar: te diremos qué opciones hay para tu tipo de muestra.

5. Lo que piden los criterios de QC de Macrogen

Una selección de librerías frecuentes, con la cantidad total y los parámetros de integridad o pureza que fijan los criterios:

Desliza para ver la tabla completa →

Extracto de los criterios de QC de Macrogen (versión del 19 de febrero de 2025); consulta la fila de tu librería en los PDF de lecturas cortas y lecturas largas. *Para PacBio HiFi, la hoja de lecturas cortas indica 5,1 µg y la de lecturas largas, 7,1 µg y 260/230 > 2,0: confirma los valores vigentes al cotizar.

6. Contaminantes frecuentes y cómo se delatan

Algunos contaminantes se ven en los ratios; otros, no:

• Fenol (fenol-cloroformo, TRIzol): absorbe en torno a 270 nm, baja el 260/280, infla el NanoDrop e inhibe las enzimas.
• Sales de guanidina (tampones de lisis y unión de los kits de columna, TRIzol): bajan el 260/230 e inhiben la librería. Un lavado extra de la columna suele resolverlo.
• Etanol (tampón de lavado): apenas se ve en el espectro y no se detecta de forma fiable con los ratios, pero inhibe las enzimas. Centrifuga la columna vacía antes de eluir.
• EDTA: secuestra el magnesio que necesitan las polimerasas y las enzimas de fragmentación. Si eluyes en TE, que sea bajo en EDTA, e indica el tampón en el pedido.
• RNasas: no alteran los ratios; solo se ven en el RIN o el DV200. Usa material libre de RNasas, conserva el ARN a −80 °C y evita descongelarlo y recongelarlo.
• Hemo (sangre): inhibe las polimerasas; lo delatan un tono pardo o rojizo y una absorbancia en torno a 400–415 nm.
• Polisacáridos, polifenoles y ácidos húmicos (plantas, hongos, suelos, heces): bajan el 260/230 e inhiben las enzimas. Usa protocolos específicos, como los basados en CTAB para plantas.
• El ácido nucleico «equivocado»: ARN en una extracción de ADN (trátalo con RNasa) o ADN genómico en una de ARN, que genera lecturas intrónicas e intergénicas en RNA-Seq (trátalo con DNasa).

Una regla útil: si los ratios son buenos pero el NanoDrop y el Qubit discrepan mucho, sospecha de otro ácido nucleico (ARN, ADN monocatenario o degradado); si los ratios son malos, de restos de la extracción.

7. Qué pasa si la muestra no cumple los criterios

En recepción, cada muestra se compara con la fila de la librería que pediste, así que la misma muestra puede servir para una y no para otra: 0,1 µg de ADN con un DIN de 7 alcanza la cantidad y el DIN que pide TruSeq Nano DNA (350), pero no la de TruSeq DNA PCR-Free (350), que es de 1,0 µg.

Los criterios de QC de Macrogen no detallan el procedimiento caso por caso, pero dan dos pistas: en las librerías de ARN FFPE, junto al umbral de DV200 figura la anotación «Hold» (en espera), y para Nanopore advierten de que la cantidad de datos puede variar según la muestra.

El procedimiento está en nuestros términos y condiciones: si una muestra no cumple los criterios, te lo comunicamos por escrito antes de procesarla y puedes elegir entre tres opciones:

• Autorizar el procesamiento «at risk»: se prepara la librería igualmente, sin garantía de resultados.
• Pedir la devolución de la muestra, con el envío a tu cargo.
• Enviar una muestra de reemplazo: volver a extraer, limpiar o concentrar. Supone un nuevo envío y un nuevo QC, pero protege el resultado.

Los plazos de entrega se cuentan desde la recepción de muestras conformes. No es lo mismo una cantidad algo justa con buena integridad que un ARN con un DV200 muy bajo. Si tu muestra queda en espera, pregúntanos qué implica cada opción para tu proyecto antes de decidir.

Preguntas rápidas

¿Puedo cuantificar solo con NanoDrop? Para estimar la pureza, sí; para declarar la cantidad, mejor no, porque el QC de recepción cuantifica por fluorescencia. Si no tienes fluorómetro, envía con margen.

¿Qué RIN necesito para RNA-Seq? En los criterios de QC de Macrogen, 7,0 (con un ratio rRNA de 1,0) para las librerías poli-A y Ribo-Zero estándar. Si el ARN es de FFPE, no te fíes del RIN: se evalúa por DV200, con un 50 % como referencia, en librerías de captura.

¿Por qué las lecturas largas piden tanto ADN? Porque la preparación suele incluir cizallado, selección de tamaño y varias limpiezas en las que se pierde material, además del propio QC. En los criterios de QC de Macrogen, las librerías de genoma piden 3,1 µg en PacBio Microbial, 6,0 µg en Nanopore ONT-LSK-114 y entre 5,1 y 7,1 µg en PacBio HiFi, según la hoja (confírmalo al cotizar).

Cómo lo hacemos en Macrogen

Comparamos cada muestra con los criterios de la librería pedida y te atendemos en español desde Madrid y Santiago. Tienes el embalaje, el hielo seco y las direcciones de cada hub en envío de muestras, y el detalle de cada servicio en RNA-Seq y secuenciación de genoma completo.

¿Dudas sobre el QC de tus muestras de ADN o ARN? Escríbenos a info-spain@macrogen.com o info-chile@macrogen.com y te orientamos en español.