Una reacción de secuenciación Sanger es químicamente sencilla, pero sensible a tres cosas: cuánto molde le das, cómo de limpio está y si el primer puede hibridar donde debe. Esta guía recorre los requisitos reales de nuestro laboratorio — los mismos que aparecen en la página del servicio — y los errores que más repeticiones causan. Si es tu primer contacto con la técnica, empieza por qué es la secuenciación Sanger.
1. Concentraciones recomendadas por tipo de muestra
Demasiado poco molde produce señal débil; demasiado, picos saturados y terminación temprana. Estos son los rangos que pedimos:
| Tipo de muestra | Tamaño | Concentración | Volumen |
|---|---|---|---|
| Producto PCR purificado | < 200 bp | 3–5 ng/µL | Mínimo 10 µL +5 µL por reacción adicional |
| 200–600 bp | 5–10 ng/µL | ||
| 600–1.000 bp | 10–20 ng/µL | ||
| > 1.000 bp | 20–50 ng/µL | ||
| Plásmido | — | 100–150 ng/µL | |
| Extracción de gel | — | 50–100 ng/µL · >30 µL |
Regla práctica: la cantidad óptima de molde escala con su tamaño, porque lo que importa es el número de moléculas, no los nanogramos. Un amplicón de 150 bp a 20 ng/µL lleva un exceso enorme de moldes; un plásmido de 8 kb a 20 ng/µL se queda corto.
Y pasarse también tiene su patrón: el exceso de molde (o de primer) produce el perfil que la guía de Applied Biosystems llama top-heavy — señal muy intensa en las primeras decenas de bases que se agota de golpe, porque la reacción consume los terminadores en fragmentos cortos. Si tus lecturas empiezan enormes y mueren pronto, no diluiste lo suficiente.
El Nanodrop mide todo lo que absorbe a 260 nm: ADN de interés, pero también ARN, nucleótidos libres y ADN degradado. Tras una miniprep o una purificación de PCR, complementa con un gel (¿una sola banda del tamaño esperado?) o un fluorómetro tipo Qubit si la cuantificación es crítica.
2. Pureza: qué te dicen los ratios A260/280 y A260/230
- A260/280 entre 1,8 y 2,0 — valores claramente menores suelen indicar proteínas o fenol residual. Matiz importante de la guía de Applied Biosystems: el ratio depende del tampón — una muestra muy limpia disuelta en agua pura puede leer 1,5–1,6, y un ratio algo bajo no siempre impide una buena lectura. Interpreta el ratio, no lo idolatres.
- A260/230 ≈ 2,0 — valores bajos delatan sales caotrópicas (guanidina), EDTA o restos de etanol del lavado.
- Fiabilidad del A260: la ley de Beer solo es lineal en un rango; con lecturas por debajo de 0,05 o por encima de 1,00 de absorbancia, diluye o concentra y vuelve a medir.
Los contaminantes más dañinos para la reacción de secuenciación son sales, etanol y EDTA: inhiben la polimerasa o interfieren en la inyección electrocinética del capilar, y producen señal débil o ruido generalizado. Y ojo con un punto ciego que la guía del fabricante señala expresamente: ni el gel ni el espectrofotómetro detectan sales — una muestra puede pasar ambos controles y aun así fallar por salinidad. Si tus ratios están fuera de rango, una reprecipitación con etanol/acetato o una columna de limpieza resuelven la mayoría de los casos.
Dos matices más del gel: un plásmido sin cortar puede correr en hasta tres bandas (superenrollado, mellado y lineal) — eso es normal, no una contaminación; y la contaminación por ARN, aunque la reacción tolera cantidades pequeñas, infla gravemente la cuantificación por absorbancia (el Nanodrop lo cuenta como si fuera tu ADN).
El producto de PCR debe llegar purificado (columna o enzimático ExoSAP): los dNTPs y primers sobrantes de la PCR compiten en la reacción de secuenciación y generan escaleras marcadas adicionales — es decir, ruido. Y una advertencia que la guía marca como crítica: si tu PCR tiene más de una banda, ni la columna, ni el ExoSAP, ni la precipitación separan el producto bueno del malo. En ese caso, purifica desde gel o reoptimiza la PCR antes de enviar.
3. El primer: la otra mitad del éxito
- Concentración: 5–10 pmol/µL, mínimo 10 µL (+5 µL por reacción adicional).
- Tm recomendada: 50–58 °C, longitud típica 18–25 nt.
- Posición: que hibride 50–100 bases antes de la región que te interesa — los primeros 20–40 nt de lectura tras el primer son de baja calidad por diseño del método.
- Un primer por reacción: a diferencia de la PCR, la secuenciación usa un único primer. Si necesitas ambas hebras, son dos reacciones.
- Evita primers con homopolímeros largos (especialmente 4 o más G seguidas), fuerte autocomplementariedad o varios sitios de unión en el molde (producirían picos dobles desde el inicio). La guía de Applied Biosystems recomienda además ≥18 nt, GC preferiblemente 50–55 % y no diseñar sobre un SNP conocido.
- Calidad de síntesis: un primer con contaminantes n−1 (moléculas a las que les falta una base, típicas de síntesis de baja pureza) genera una segunda escalera desfasada — picos dobles desde el inicio. Para primers críticos, pide purificación HPLC.
Si tu construcción lleva sitios estándar (M13, T7, SP6, CMV…), no necesitas enviar primer: usa los 96 primers universales gratuitos que mantenemos en stock e indícalo al registrar el pedido.
4. Formatos de envío: tubo, premix o placa
| Formato | Qué envías | Cuándo conviene |
|---|---|---|
| Standard | Molde y primer en tubos separados | Pocas muestras con primers distintos · máxima flexibilidad |
| Premix | Molde + primer ya mezclados en un tubo | El más económico por reacción (desde 4,2 € / USD 4,5) · rutina de verificación de clones |
| Placa 96 / 48 | Muestras en placa siguiendo las coordenadas A1–H12 | Proyectos grandes · el coste por muestra baja de 3 € / USD 3 |
En placas, un punto crítico de trazabilidad: el orden físico de los pocillos debe coincidir exactamente con el registrado en el portal. Un desfase de una fila convierte 96 resultados correctos en 96 resultados inutilizables.
5. Checklist final antes de enviar
- Concentración dentro del rango para tu tipo de muestra (tabla de arriba).
- Ratios A260/280 ≈ 1,8 y A260/230 ≈ 2,0 verificados.
- Producto PCR purificado y con una sola banda en gel.
- Primer a 5–10 pmol/µL — o primer universal indicado en el pedido.
- Volúmenes suficientes: 10 µL + 5 µL por reacción extra.
- Tubos etiquetados con los mismos nombres que en el registro del portal (etiqueta lateral, no en la tapa).
- Pedido registrado antes del envío físico.
Las instrucciones logísticas completas — direcciones de Madrid y Santiago, embalaje y temperatura de envío — están en la guía de envío de muestras.
6. ¿Y si aun así sale mal?
A veces el problema no está en la preparación sino en el molde mismo: regiones ricas en GC, horquillas u homopolímeros que la polimerasa no resuelve. Antes de repetir a ciegas, mira el cromatograma — el patrón del fallo dice casi siempre cuál fue la causa. Tenemos una guía dedicada: cómo interpretar un cromatograma Sanger.
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Solicitar cotización Sanger →Criterios técnicos contrastados con la guía de química DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis (Applied Biosystems / Thermo Fisher, 3.ª ed.), la referencia del fabricante de los secuenciadores ABI 3730xl que usamos en Macrogen.
¿Dudas sobre si tu muestra cumple los requisitos? Escríbenos a info-spain@macrogen.com o info-chile@macrogen.com antes de enviar · mejor prevenir que repetir.